癌症是目前世界上的主要致死疾病。伴随癌细胞发展产生的药物抗性是限制癌症治疗的重要因素之一。以往研究表明，肿瘤微环境中的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）刚度对癌细胞的抗药性产生直接影响。另外，癌细胞膜上的多药耐药蛋白1（multidrug resistance protein 1，MRP1）可主动将抗癌药物泵出癌细胞，在癌细胞抗药性中发挥重要作用。但一方面，目前有关ECM刚度和癌细胞MRP1功能活性间的关系仍不清楚；另一方面，传统的荧光表征方法主要对MRP1的表达进行分析, 无法表征药物作用下这种作为外排泵蛋白的实时活性，另外在监测癌细胞MRP1功能活性过程中须保持保证细胞活性, 因此需要可原位表征癌细胞MRP1功能活性的技术。扫描电化学显微镜（scanning electrochemical microscopy，SECM）作为一种微区电化学扫描探针显微镜技术，通过记录微/纳米电极探针在细胞表面扫描时的氧化还原电流等信息，可在生理条件下（如细胞培养液中）对活细胞的形态和消耗/释放的化学小分子等进行原位、实时表征，并以其高时空分辨率和非侵入性表征的技术优点成为活细胞生化特性等研究的有力工具。
基于以上背景，西安交通大学生命科学与技术学院仿生工程与力学研究所（BEBC）的研究人员组以乳腺癌细胞为癌细胞模型，基于不同硬度聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PA）水凝胶构建了乳腺癌细胞的力学微环境体外模型，结合SECM技术原位研究了肿瘤微环境中基质刚度对癌细胞MRP1功能活性的影响（图1），得到了不同基质刚度下癌细胞MRP1功能活性的定量数据。
图1. SECM表征乳腺癌细胞（MCF-7和MDA-MB-231细胞）MRP1功能活性的示意图。（a）三种硬度PA胶模拟乳腺癌细胞不同发展阶段的ECM硬度；（b）使用SECM表征PA胶上乳腺癌细胞MRP1功能活性的示意图
该工作首先以对抗癌药物具备不同敏感性的乳腺癌细胞系MCF-7（雌激素受体阳性乳腺癌细胞）和MDA-MB-231（三阴性乳腺癌细胞）为癌细胞模型，首先通过制备不同硬度（2.5、17.1、26.2 kPa）的PA胶用以模拟从良性到恶性病变不同阶段的乳腺癌细胞外基质刚度值，之后将两种乳腺癌细胞在三种硬度PA胶上培养，构建了体外乳腺癌细胞的力学微环境模型。为探究ECM刚度对癌细胞MRP1功能活性的影响，以FcCOOH为氧化还原电对，以乳腺癌细胞释放的GSH的表观速率常数k与MRP1功能活性的对应关系，应用SECM对不同硬度PA胶上的两种乳腺癌细胞的MRP1功能活性进行了原位表征。通过比较不同基质刚度上乳腺癌细胞释放GSH的表观速率常数k值，证实ECM刚度变化可改变乳腺癌细胞MRP1的功能活性。如图2，硬基质上培养的乳腺癌细胞k值明显高于软基质的k值。表明随基质刚度增加，乳腺癌细胞的MRP1功能活性增加。
图2. MCF-7和MDA-MB-231细胞在三种硬度PA胶上的（a, b）SECM渐进曲线和（c, d）k值统计结果。
为证实乳腺癌细胞释放GSH的表观速率常数k值取决于MRP1功能活性的改变，加入MRP1抑制剂（MK571）进行了MRP1的抑制实验，再应用SECM对不同硬度PA胶上两种乳腺癌细胞的MRP1功能活性进行了表征。如图3，通过比较不同基质刚度上乳腺癌细胞释放GSH的表观速率常数k值，证实k值的改变取决于MRP1活性的改变，并且在加入MK571后，三种硬度PA胶上的乳腺癌细胞k值均降，证实了ECM刚度的变化引起的乳腺癌细胞MRP1功能活性的变化。
图3. MRP1抑制剂（MK571）处理后MCF-7和MDA-MB-231细胞在三种硬度PA胶上的（a, b）SECM渐进曲线和（c, d）k值统计结果
接着研究了ECM刚度对乳腺癌细胞MRP1表达量的可能影响。通过免疫荧光染色、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印记（western blot）等方法对不同硬度PA胶上两种乳腺癌细胞的MRP1表达量进行了表征。如图4，通过比较不同基质刚度上乳腺癌细胞的MRP1表达量，证实ECM刚度变化不影响乳腺癌细胞的MRP1表达量：三种硬度PA胶上乳腺癌细胞的MRP1 mRNA水平和蛋白表达水平无显著差异。实验结果首次证实ECM刚度的增加增强了乳腺癌细胞MRP1的功能活性，但并不改变MRP1的表达量。
图4. MCF-7和MDA-MB-231细胞在三种硬度PA胶上的（a, b）免疫荧光图像，（c, d）荧光强度统计图，（e）MRP1蛋白表达量及（f, g）MRP1 mRNA表达水平
为进一步探究ECM刚度对乳腺癌细胞MRP1药物外排能力的影响，选用长春新碱（vincristine, VCR）（一种MRP1特异性的与GSH共转运的底物，同时也是一种广谱癌症化疗药物）作为评价MRP1药物外排能力变化的代表药物。通过比较不同基质刚度上乳腺癌细胞释放GSH的表观速率常数k值，证实ECM刚度变化可改变乳腺癌细胞MRP1外排药物的能力。如图5，硬基质上培养的乳腺癌细胞k值明显高于软基质的k值，表明随基质硬度增加，乳腺癌细胞MRP1对VCR 的外排增加。
图5. 长春新碱（VCR）处理后的MCF-7和MDA-MB-231细胞在三种硬度PA胶上的（a, b）SECM渐进曲线和（c, d）k值统计结果
通过比较不同基质刚度上两种乳腺癌细胞在加长春新碱前后释放GSH的表观速率常数k值，证实了ECM刚度对乳腺癌细胞MCF-7的外排 VCR的影响大于对MDA-MB-231的外排 VCR的影响。如图6，在相同硬度PA胶上，MCF-7细胞加药前后的k值都小于MDA-MB-231细胞的k值，VCR处理后MCF-7细胞在三种硬度PA胶上的k值均高于MDA-MB-231细胞的k值，说明ECM刚度对MCF-7细胞外排VCR的影响大于对MDA-MB-231细胞的影响。以上实验结果显示，ECM刚度对不同亚型乳腺癌细胞MRP1外排VCR的能力有不同影响，证实了癌细胞微环境中的ECM刚度在乳腺癌化疗耐药中具有一定作用。
图6. MCF-7和MDA-MB-231细胞在硬度为2.5、17.1和26.2 kPa PA胶上加长春新碱（VCR）前后MRP1功能活性的比较。
该工作首次应用SECM对癌细胞微环境中不同基质刚度上的癌细胞MRP1功能活性进行了原位表征，证实了ECM刚度对癌细胞MRP1功能活性的直接影响。该成果以“In situ monitoring of functional activity of extracellular matrix stiffness-dependent multidrug resistance protein 1 using scanning electrochemical microscopy”为题发表在英国皇家化学会旗下期刊Chemical Science上。文章共同第一作者为BEBC硕士研究生曙阿克·库尔曼巴依和杨耀维，通讯作者为李菲教授和徐峰教授，其他作者还包括BEBC博士研究生赵宇翔和李亚北，西安交通大学第一附属医院肿瘤内科王乐医生和杨谨教授以及BEBC助理教授周彦博士等。该工作也得到BEBC老师和同学们的大力协助以及国家自然科学基金、陕西省自然科学基金、陕西省重点研发计划和中央高校基本科研业务费等项目的资助。
论文信息
In situ monitoring of functional activity of extracellular matrix stiffness-dependent multidrug resistance protein 1 using scanning electrochemical microscopy
Shuake Kuermanbayi#（曙阿克·库尔曼巴依）, Yaowei Yang#（杨耀维），Yuxiang Zhao（赵宇翔）, Yabei Li（李亚北）, Le Wang（王乐）, Jin Yang（杨谨）, Yan Zhou（周彦）, Feng Xu*（徐峰），Fei Li*（李菲）
Chem. Sci. 2022
原文链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2022/sc/d2sc02708a
